موضوع پایان نامه دکتری :بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله‌ها و بزهای کشتارشده به روش PCR

مقدمه
عفونت پلوروپنومونی واگیر،‌ بیماری تحلیل برنده تنفسی است که با جای گرفتن در طبقه‌بندی بیماریهای سازمان جهانی کنترل بیماریهای واگیر، لزوم و اهمیت شناسایی آن مشخص شده است. عامل اصلی این بیماری، گونه مایکوپلاسما مایکوئیدس می‌باشد که تایپ کلونی کوچک آن  بطور اختصاصی به گله‌های گاو، خسارات فراوانی ناشی از همه‌گیری گسترده و مرگ و میر فراوان تحمیل کرده است.
تایپ کلونی بزرگ این گونه  همراه با دو گونه دیگر بنامهای مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری کولوم  و مایکوپلاسما مایکوئیدس کاپری  فرم غیرکلاسیک پلوروپنومونی واگیر را در گله‌های گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. این بیماری در فرم کلاسیک، که عامل آن مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری پنومونی  شناخته می‌شود، خسارات اقتصادی سهمگینی در گله‌های بز و گوسفند موجب گردیده است.
از آنجائیکه منطقه خاورمیانه جزو مناطق مشکوک به آلودگی پلوروپنومونی واگیر محسوب می‌شود، حفظ وضعیت عاری بودن از عفونت در این منطقه، مشکل یا تقریبا غیرممکن بوده و نیازمند بازنگری درراهبردهای بکار رفته به منظور تشخیص و کنترل این عفونت‌هاست. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک تشخیصی و پاتولوژیکی‌، مسیر بیماریزایی ناشناخته و تنوع فنوتیپی بسیار پیچیده ارگانیسم در مواجهه با دستگاه ایمنی میزبان، بر مشکل شناسایی آن افزوده است. علاوه بر  این ، ابقا طولانی مدت باکتری در محل عفونت و وجود ناقلین بدون علامت‌، برنامه کنترل بیماری را با چالش روبرو کرده است.
از این رو، شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی و تفریقی گونه‌های کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس که هرکدام استراتژی جداگانه ای در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.
از آنجایی که مایکوپلاسماهای پاتوژن در محیط کشت به سختی رشد می‌کنند، استفاده  متداول از روش کشت و جداسازی، شناسایی عفونت گله‌ها را با مشکل روبرو کرده است.
از طرف دیگر، عمدتا به دلیل تشابه آنتی ژنتیکی بین گونه‌های کلاستر مایکوئیدس و سایر گونه‌های مایکوپلاسما، روشهای سرولوژی از دقت و ویژگی کافی در تمایز گونه‌ها برخوردار نیستند. لذا به رهیافت روش‌های مولکولی مانندPCR بعنوان روشی سریع،  دقیق و با حساسیت و ویژگی مطلوب در کنترل عفونت گله‌ها، توجه ویژه‌ای می‌شود.
هدف از این مطالعه، بررسی عفونت‌های تنفسی ناشی از کلاستر مایکوئیدس در  گله‌های نشخوارکنندگان از طریق کشت و PCR می‌باشد.

فهرست

عنوان ……………………………………………………………………………………… صفحه

الف- ۱

فصل اول:کلیات …………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۵

۱- تاریخچه    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۶

۲- خصوصیات کلی مایکوپلاسما…………………………………………………………………………………………………………….. ۶

۳- مقاومت مایکوپلاسماها………………………………………………………………………………………………………………………. ۸

۴- طبقه بندی مایکوپلاسماها…………………………………………………………………………………………………………………. ۹

۵- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس………………………………………………………………………………………………………… ۱۲

۶- فیلوژنی   ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۴

۷- ساختمان  …………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۵

۱-۷-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس …………………………………………………………………………………………………… ۱۵

۲-۷- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم …………………………………………………………………………………………… ۱۷

۸- بیولوژی مولکولی……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۹

۹- توالی‌های تکراری……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۲۳

۱۰- پروتئینهای سطحی………………………………………………………………………………………………………………………….. ۲۵

۱۱- فاکتور حدت………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۰

۱۲- آنالیز پروتئین  ………………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۲

۱۳- طبقه بندی سویه‌ها ………………………………………………………………………………………………………………………… ۳۴

۱۴- مشخصات گونه مایکوئیدس…………………………………………………………………………………………………………… ۳۵

۱۵- کشت و رشد گونه مایکوئیدس ……………………………………………………………………………………………………… ۳۸

۱۶- کشت و رشد گونه کاپری کولوم …………………………………………………………………………………………………… ۴۱

۱-۱۶- محیط Thiacourt  ……………………………………………………………………………………………………………………. ۴۱

۱۷- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان……………………………………………………………………………………………….. ۴۴

۱-۱۷- علائم بالینی ……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۴۵

۲-۱۷- علائم کالبدگشایی بیماری …………………………………………………………………………………………………………. ۴۷

۳-۱۷- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۰

۱-۳-۱۷- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی…………………………………………………………………………………….. ۵۳

۴-۱۷- اختصاصیت میزبان…………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۷

۵-۱۷- انتقال بیماری  …………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۸

۶-۱۷- سیر همه گیری ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۵۹

فهرست

عنوان صفحه

۱-۶-۱۷- مخزن………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۵۹

۲-۶-۱۷- راه انتقال………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۹

۷-۱۷- پیشگیری و کنترل………………………………………………………………………………………………………………………. ۶۰

۱-۷-۱۷- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری…………………………………………………………………. ۶۱

۲-۷-۱۷- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری…………………………………………………………………………………………… ۶۲

۳-۷-۱۷- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی……………………………………………………………………………………….. ۶۳

۱۸- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان ……………………………………………………………………………………………….. ۶۳

۱-۱۸- علائم بالینی ……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۶۴

۲-۱۸- علائم کالبد گشایی………………………………………………………………………………………………………………………. ۶۶

۱۹- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم…………………………………………………………………………………… ۶۹

۱-۱۹- سندروم MASKePs…………………………………………………………………………………………………………………. 70

2-19- علائم بالینی…………………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۳-۱۹- علائم کالبد گشایی………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۴-۱۹- سندروم آگالاکتیه واگیر……………………………………………………………………………………………………………… ۷۳

۲۰- گونه مایکوپلاسما کاپری ……………………………………………………………………………………………………………….. ۷۳

۱-۲۰- بیماریزایی ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۷۳

۲-۲۰- علائم کالبد گشایی………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۴

۲۱- سیر همه‌گیری……………………………………………………………………………………………………………………………….  ۷۵

۱-۲۱-مخزن  …………………………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۵

۲-۲۱-راه انتقال…………………………………………………………………………………………………………………………………….       ۷۶

۳-۲۱-جمعیت میزبان……………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۷

۲۲-پیشگیری وکنترل ………………………………………………………………………………………………………………………….        ۷۷

۱-۲۲- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری………………………………………………………………..       ۷۷

۲-۲۲- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری…………………………………………………………………………………………….  ۷۸

۳-۲۲- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی…………………………………………………………………………………………  ۷۸

۲۳-واکسن    …………………………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۹

۱-۲۳-واکسن MmmLC ……………………………………………………………………………………………………………………        ۷۹

۲-۲۳-واکسن Mccp …………………………………………………………………………………………………………………………..   ۷۹

۳-۲۳-واکسن Mcc  …………………………………………………………………………………………………………………………….  ۷۹ ۷۹-اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس  ………………  ………………………………………………………………………………………………………….        ۸۰

فهرست

عنوان …………………………………………………………………………………………….. صفحه

۲۵-تشخیص افتراقی……………………………………………………………………………………………………………………………. ۸۰

۱-۲۵-شناسایی عامل بیماری زا ……………………………………………………………………………………………………….. ……..             ۸۱

۱-۱-۲۵-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی……………………….. ۸۱

۲-۲۵- تشخیص آزمایشگاهی …………………………………………………………………………………………………………….  ۸۱

۱-۲-۲۵- روش کشت و جداسازی………………………………………………………………………………………………………. ۸۱

۱-۱-۲-۲۵- انتخاب نمونه ها ……………………………………………………………………………………………………………………..  ۸۲

۲-۱-۲-۲۵- آماده سازی نمونه ها …………………………………………………………………………………………………….        ۸۲

۳-۲۵- تستهای بیوشیمی……………………………………………………………………………………………………………………. ۸۳

۴-۲۵- روشهای سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………….. ۸۵

۱-۴-۲۵- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی …………………………………………………………………………………………             ۸۵

۲-۴-۲۵- تست مهاری رشد  ……………………………………………………………………………………………………………………….  ۸۷

۳-۴-۲۵- تست ایمونو فلورسانس …………………………………………………………………………………………………………….  ۸۸

۴-۴-۲۵- تست رسوب ژلی…………………………………………………………………………………………………………………. …….. ۸۸

۵-۴-۲۵- تست فیکساسیون کامپلمان ………………………………………………………………………………………………………..  ۸۹

۶-۴-۲۵- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون ……………………………………………………………………………………………..  ۸۹

۷-۴-۲۵- تست آگلوتیناسیون لاتکس……………………………………………………………………………………………….. ۹۰

۸-۴-۲۵- تست الیزای رقابتی……………………………………………………………………………………………………………… ۹۱

۹-۴-۲۵- سایر تستهای تشخیصی…………………………………………………………………………………………………….. ۹۴

۵-۲۵ – مشکلات روشهای سنتی…………………………………………………………………………………………………………. ۹۴

۶-۲۵- تشخیص با استفاده از PCR…………………………………………………………………………………………………. 95

فصل دوم: روش کار

۲۶- روش کار ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۱

۱-۲۶- جمع آوری نمونه …………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۱-۱-۲۶- مواد لازم……………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۲-۱-۲۶- بخش جمع آوری نمونه………………………………………………………………………………………………………. ۱۰۱

۳-۱-۲۶- نمونه برداری ……………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۳

۲-۲۶- کشت و جداسازی نمونه ها……………………………………………………………………………………………………… ۱۰۴

۱-۲-۲۶- مواد لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۴

فهرست

عنوان …………………………………………………………………………………………….. صفحه

۲-۲-۲۶- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان ……………. ۱۰۶

۱-۲-۲-۲۶- مواد لازم …………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۰۶

۲-۲-۲-۲۶- روش تهیه محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۷

۳-۲۶- استخراج DNA مایکوپلاسما………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۹

۱-۳-۲۶- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی…………………………………………………………………………….. ۱۰۹

۴-۲۶- فرایند PCR ……………………………………………………………………………………………………………………………. 110

1-4-26- مواد لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۱۰

۲-۴-۲۶- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR ……………………………………………………………………………………….. 112

1-2-4-26- افزوده سازی DNA نمونه‌ها ……………………………………………………………………………………….. ۱۱۲

۲-۲-۴-۲۶- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده………………………………………………………………………. ۱۱۵

۳-۲-۴-۲۶- تهیه مخلوط اصلی اولیه………………………………………………………………………………………………… ۱۱۵

۳-۴-۲۶- پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۱۵

۴-۲۶- واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………… 117

5-26- تهیه ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… ۱۱۸

۱-۵-۲۶- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید ……………………………………………………………………………………………….. ۱۱۹

۶-۲۶- الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۱

۷-۲۶- رویت باندهای ایجاد شده ………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۲

فصل سوم: نتایج

۲۷- نتایج    ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۲۷- جداسازی…………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۱-۲۷- بررسی عملکرد محیط کشت………………………………………………………………………………………………. ۱۲۴

۲-۱-۲۷- نتایج کشت نمونه های ارسالی ………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۲-۱-۲۷- نتایج روز پنجم  ……………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۵

۲-۲-۱-۲۷- نتایج روزهفتم تا دهم…………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۵

۳-۲-۱-۲۷- نتایج روزپانزدهم…………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۶

۲-۲۷- نتایج  PCR  ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۶

۱-۲-۲۷- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر جنس ……………………………………………………………………………. ۱۲۶

۲-۲-۲۷- تائید کلونی های جدا شده………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۷

۳-۲-۲۷- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس……………………………………………………… ۱۲۷

۴-۲-۲۷- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه………………………………………………………………. ۱۲۸

۵-۲-۲۷- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ…………………………………… …….. ۱۲۹

۳-۲۷- نتایج کالبد گشایی………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۳۰

۱-۳-۲۷- معیار انتخاب ………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۳۰

 

فهرست

عنوان صفحه

فصل چهارم: بررسی نتایج

نمودارها       ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۱

فصل پنجم: بحث

۲۸- بحث      ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۹

۱-۲۸- ضایعات کالبد گشایی……………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۹

۲-۲۸- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما ………………………………………………………………………………. ۱۴۱

۳-۲۸- روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۴۲

۴-۲۸- روش  PCR  ………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۴۷

۵-۲۸- فراوانی گونه ها ………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۵۲

۲۹- خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۵۹

۳۰- منابع    ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۶۰

فهرست تصاویر

عنوان  …………………………………………………………………………………….. صفحه

تصویر شماره ۱: کلونی تخم مرغی شکل مایکوپلاسما پس از سومین ساب کالچر………………….. ۱۲۵

تصویر شماره ۲:  آزمایش  PCR برای تشخیص جنس مایکوپلاسما در نمونه ریه……………….. ۱۲۷

تصویر شماره ۳: آزمایش PCR  برای تشخیص کلاستر مایکوئیدس در نمونه ریه……………….            ۱۲۸

تصویر شماره ۴: آزمایش PCR برای تشخیص گونه آگالاکتیه درنمونه ریه………………………….                                                                   ……………………………………………………………………………………………………………………………………                                                                   ……………………………………………………………………………………………………………………………………                                                                   ……………………………………………………………………………………………………………………………………                                                                   ……………………………………………………………………………………………………………………………………            ۱۲۹

تصویر شماره ۵: آزمایش PCR برای تشخیص گونه مایکوئیدس مایکوئیدس کلونی بزرگ.. ۱۳۰

فهرست جداول

عنوان  …………………………………………………………………………………….. صفحه

جدول۱:  طبقه بندی مایکوپلاسما…………………………………………………………………………………………………………………   ۱۱

جدول  ۲: معرفی اعضا کلاستر مایکوئیدس و خصوصیات بیماریزایی آنها …………………………………..   ۱۱

جدول ۳: احتیاجات غذایی برای رشد مایکوپلاسماهای کلاستر مایکوئیدس……………………………………. ۳۹

جدول ۴ : مقادیر موردنیاز جهت تهیه مخلوط اصلی اولیه……………………………………………………………….. ۱۱۲

جدول ۵: مواد مورد نیاز واکنش تکثیر ……………………………………………………………………………………………… ۱۱۴

جدول۶ : پرایمرهای استفاده شده در واکنش تکثیر …………………………………………………………………………. ۱۱۶

جدول ۷ : برنامه واکنش پرایمرها ………………………………………………………………………………………………………  ۱۱۸

جدول۸: : فرمول تهیه محیط  TBE(5X)……………………………………………………………………………………………. 120

جدول۹: میزان اتیدیوم بروماید مصرفی جهت ساختن مقادیر متفاوت ژل ………………………………………. ۱۲۰

فهرست نمودارها

عنوان ……………………………………………………………………………………………..                 صفحه

نمودار شماره ۱: درصد مایکوپلاسمای جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسی

گله‌های مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………………………………….                        ۱۳۲

 نمودارشماره ۲: درصد حضور مایکوپلاسما درعفونت تنفسی گله‌های مورد

مطالعه به روشPCR …………………………………………………………………………………………………………………… 132

نمودار شماره۳ : مقایسه روشهای کشت و PCR در تشخیص  مایکوپلاسما ی موجود در عفونت تنفسی گله‌های مورد مطالعه   ۱۳۳

نمودار شماره۴: مقایسه نتایج کشت وPCR  نمونه‌ها در گله‌های مورد مطالعه (n=100) …… 133

نمودار شماره ۵: مقایسه نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گاو  (n=50) ………………………….  ۱۳۴

نمودار شماره ۶: مقایسه  نتایج کشت و PCR مایکوپلاسما در گله های  گوسفند (n=30) …..  ۱۳۴

نمودار شماره ۷: مقایسه نتایج کشت و PCR در گله‌های بز (n=20)……………………………………… 135

نمودار شماره۸: نمودار شماره ۸:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR  مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100)       ۱۳۵

نمودار شماره ۹: نمودار شماره۹:مقایسه نتایج ایجاد کدورت در محیط براث و جداسازی مایکوپلاسما در گله‌های مورد مطالعه (n=100)       ۱۳۶

نمودار شماره ۱۰: نمودار شماره۱۰: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR   مایکوپلاسما
در گله‌های گاو(n=50)……………………………………………………………………………………………………………………. 136

نمودار شماره ۱۱: نمودار شماره ۱۱:مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR  مایکوپلاسما
در گله‌های بز (n=20)……………………………………………………………………………………………………………………. 137

نمودار شماره۱۲: مقایسه نتایج تشکیل کدورت در محیط براث و PCR مایکوپلاسما در گله‌های گوسفند (n=30)        ۱۳۷

Refrences:

1. Abdo E M, Nicolet J, Frey J. (2000). Antigenic and genetic characterization of LPPQ from Mycoplasma mycoides mycoides Small Colony.Clin Diag Lab Immun.7:4, 588-593.

 

1. Adehan R K, Ajuwape A T P, Adetosoye A I, Alaka O O. (2007). Biochemical and serological identificatrion of Mycoplsma isolated from pneumonic lungs of cattle. Philipine J Vet Med. 44:1, 8-13.

 

1. Alberti A, Robino P, Chessa B, Rosati  S, Filippa Addis M, Mercier P, Mannelli A, Cubeddu T, Profiti M, Bandino E, Thiery  R, Pittau M. (2007). Characteriterization of Mycoplasma capricolum capricolum P650 surface lipoprotein and its evaluation in a recombinant ELISA. Vet Mic.In Press.

 

1. Amanfu W, Sediadie S, Masupu K V, Raborokgwe MV, Benkirane A, Geiger R, Thiaucourt F. (2000). Comparison between c-ELISA and CFT in detecting antibodies to Mycoplasma mycoides mycoides Small Colony in cattle affected by Contagious Bovine Pleuropneumonia in Botswana. Annals of the New York Academy of Sciences. 916: 364-369.

 

1. Arif A, Schulz J. (2007). Contagious Caprine Pleuro Pneumonia outbreak in captive wild ungurates at AlWabra Wildlife preservation. state of Qatar. J of Zoo and Wildlife Med. 38:1, 93-96.
2. Ayling R D, Nicholas R A J. (2005). Treatment of mycoplasmosis infections. Proceedings of the 38^th annual convention, American Association of Bovine Practitioners, USA. 2005: 6-10.

 

1. Barbosa V P, Nascimento E R, Danelli M, Nascimento M, Santos M A J, Lignon G B, Ribeiro V R. (2000). Differentiation of Mycoplasma mycoides types causing mycoplasmosis in goats.Revista Brasilia de Veterinaria. ۷:۱, ۳۳-۳۶٫

دانلود فایل